【碩士】不對(duì)稱合成手性醇及其反Prelog脫氫酶研究

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　　【碩士】不對(duì)稱合成手性醇及其反Prelog脫氫酶研究　　授予學(xué)位：碩士　　學(xué)位授予單位：南京工業(yè)大學(xué)　　學(xué)位年度：2010　　光學(xué)純的手性醇是化學(xué)合成中廣泛應(yīng)用的重要手性砌塊，其中(R)-和(S)-2-辛醇是合成類固醇、昆蟲(chóng)性外激素(生物殺蟲(chóng)劑)等光學(xué)活性藥物和農(nóng)藥的中間體，特別是制備高性能液晶及液晶組件不可或缺的原料。利用微生物醇脫氫酶(ADH)對(duì)潛手性酮進(jìn)行不對(duì)稱還原制備單一對(duì)映體的手性醇是當(dāng)前手性合成的研究熱點(diǎn)，因其具有立體選擇性好、理論產(chǎn)率高(100％)、環(huán)境友好等的特點(diǎn)。論文以本研究室篩選到的一株不對(duì)稱還原2．辛酮生成(月)一2．辛醇的酒明串珠菌Gk門(mén)D∞cc淞DP刀f CECT 4730為基礎(chǔ)，著眼于工業(yè)化生產(chǎn)，以時(shí)空產(chǎn)率為目標(biāo)，采用原位分離技術(shù)構(gòu)建了新的水／有機(jī)溶劑兩相反應(yīng)系統(tǒng)，對(duì)全細(xì)胞不對(duì)稱制備(R)．2．辛醇進(jìn)行研究，并對(duì)D DP刀f CECT 4730中起關(guān)鍵催化作用的反Prelog規(guī)則(R)-ADH進(jìn)行了分離純化和酶學(xué)性質(zhì)研究。主要工作及取得的結(jié)論如下：　　 (1)通過(guò)比較酒明串珠菌D．DP衙CECT4730在6中常見(jiàn)明串珠菌培養(yǎng)基上生長(zhǎng)和產(chǎn)(R)．ADH的情況，發(fā)現(xiàn)ATB培養(yǎng)基為最適的發(fā)酵培養(yǎng)基類型。通過(guò)Plackett．Bu徹an試驗(yàn)選出ATB中對(duì)該菌發(fā)酵產(chǎn)酶具有顯著正效應(yīng)的3個(gè)因素，按其重要性依次為：番茄汁、酵母膏、檸檬酸氫二銨。并且發(fā)現(xiàn)ATB培養(yǎng)基中番茄汁濃度較高時(shí)，其對(duì)D DP刀fCECT4730發(fā)酵產(chǎn)(尺)．ADH的促進(jìn)作用比對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的促進(jìn)作用更為明顯。通過(guò)響應(yīng)面分析確定了各顯著性影響因素的最優(yōu)水平，從而確定了D．oP刀f CECT4730發(fā)酵培養(yǎng)基的最適配方為：葡萄糖1％、蛋白胨1％、鹽酸．L．半胱氨酸0．05％、MgS04·7H20 0．02％、MnS04·4H20 O．005％、吐溫80 O．1％、番茄汁23．8％、酵母膏0．52％、檸檬酸氫二銨0．34％，pH 4．9。與優(yōu)化前相比，全細(xì)胞脫氫酶活力提高了133．4％；菌體細(xì)胞量提高了12．8％?！　? (2)通過(guò)搖瓶靜置發(fā)酵對(duì)0．DP刀f CECT4730發(fā)酵產(chǎn)酶的非營(yíng)養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定的最適條件為：種齡36 h，接種量10％，溫度30 ，起始pH 4．9，裝液量為200 m拋50rnl。以7 L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵放大試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)接種前充入C02形成厭氧環(huán)境更有利于該菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶，該菌對(duì)剪切力敏感，最適攪拌轉(zhuǎn)速為50 r／mill，與搖瓶靜置發(fā)酵相比，發(fā)酵周期縮短了約4 h，全細(xì)胞脫氫酶活力(12.91 Uvs 12.84 U)和菌體細(xì)胞量(OD600)(1.597 vs 1.574)均有一定程度的提高?！　? (3)運(yùn)用原位分離技術(shù)構(gòu)建了適合D DP刀f CECT4730全細(xì)胞催化反應(yīng)的新的Tis-HCl／正壬烷兩相反應(yīng)系統(tǒng)。通過(guò)對(duì)搖瓶反應(yīng)中的限制性因素的考察，發(fā)現(xiàn)吲圪(v～)、pH、溫度、搖床轉(zhuǎn)速、輔助底物及底物濃度等均能對(duì)反應(yīng)產(chǎn)率和反應(yīng)初速度產(chǎn)生明顯影響，而只有pH和溫度能對(duì)產(chǎn)物ee值產(chǎn)生影響。在最適反應(yīng)條件下(吲圪1：1、pH 8．O、溫度30 、搖床轉(zhuǎn)速150 r／min、輔助底物葡萄糖和細(xì)胞用量比5．4：1(朋砌)、細(xì)胞和底物的用量比0．51：l(舢01))，當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到0．94 mo兒時(shí)，反應(yīng)24 h，時(shí)空產(chǎn)率的最大值比前期的研究提高了26．3％，達(dá)24伽mo兒．h，產(chǎn)物的ee僻)>98％?！　? (4)從2 L發(fā)酵液中約11 g濕菌體開(kāi)始目的酶的純化，經(jīng)超聲波破碎細(xì)胞、硫酸銨鹽析、Q-Sepharose—FF陰離子柱層析、Sephacryl S·200凝膠柱層析后，得到約0．36 mg電泳純的(R)．ADH，活力為254．5 U／mg，酶活收率為2．4％，純化倍數(shù)約25．6倍。純酶的催化反應(yīng)遵循反Prelog規(guī)則，還原2．辛酮得到的產(chǎn)物的ee(尺)達(dá)到98．9％?！　? (5)該酶的主要酶學(xué)性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)：其分子量為100 l(Da仕10 kDa，亞基分子量49 kDa(士2 kDa)，為雙亞基結(jié)構(gòu)。最適pH為8．0，最適溫度為30 oC，均與全細(xì)胞催化反應(yīng)的最適條件一致。Pb2+，A礦，和H礦+對(duì)其活力有較大的抑制作用；Fe3+，cu2+和zn2+次之。其底物選擇性按2．己酮<2．庚酮<苯乙酮<2．辛酮的順序表現(xiàn)為越來(lái)越適合該酶催化，而這些甲基酮取代基的大小依次為C4H曠

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