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【碩士】不對稱合成手性醇及其反Prelog脫氫酶研究

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內(nèi)容簡介

  【碩士】不對稱合成手性醇及其反Prelog脫氫酶研究  授予學(xué)位:碩士  學(xué)位授予單位:南京工業(yè)大學(xué)  學(xué)位年度:2010   光學(xué)純的手性醇是化學(xué)合成中廣泛應(yīng)用的重要手性砌塊,其中(R)-和(S)-2-辛醇是合成類固醇、昆蟲性外激素(生物殺蟲劑)等光學(xué)活性藥物和農(nóng)藥的中間體,特別是制備高性能液晶及液晶組件不可或缺的原料。利用微生物醇脫氫酶(ADH)對潛手性酮進(jìn)行不對稱還原制備單一對映體的手性醇是當(dāng)前手性合成的研究熱點,因其具有立體選擇性好、理論產(chǎn)率高(100%)、環(huán)境友好等的特點。論文以本研究室篩選到的一株不對稱還原2.辛酮生成(月)一2.辛醇的酒明串珠菌Gk門D∞cc淞DP刀f CECT 4730為基礎(chǔ),著眼于工業(yè)化生產(chǎn),以時空產(chǎn)率為目標(biāo),采用原位分離技術(shù)構(gòu)建了新的水/有機(jī)溶劑兩相反應(yīng)系統(tǒng),對全細(xì)胞不對稱制備(R).2.辛醇進(jìn)行研究,并對D DP刀f CECT 4730中起關(guān)鍵催化作用的反Prelog規(guī)則(R)-ADH進(jìn)行了分離純化和酶學(xué)性質(zhì)研究。主要工作及取得的結(jié)論如下:   (1)通過比較酒明串珠菌D.DP衙CECT4730在6中常見明串珠菌培養(yǎng)基上生長和產(chǎn)(R).ADH的情況,發(fā)現(xiàn)ATB培養(yǎng)基為最適的發(fā)酵培養(yǎng)基類型。通過Plackett.Bu徹an試驗選出ATB中對該菌發(fā)酵產(chǎn)酶具有顯著正效應(yīng)的3個因素,按其重要性依次為:番茄汁、酵母膏、檸檬酸氫二銨。并且發(fā)現(xiàn)ATB培養(yǎng)基中番茄汁濃度較高時,其對D DP刀fCECT4730發(fā)酵產(chǎn)(尺).ADH的促進(jìn)作用比對細(xì)胞生長的促進(jìn)作用更為明顯。通過響應(yīng)面分析確定了各顯著性影響因素的最優(yōu)水平,從而確定了D.oP刀f CECT4730發(fā)酵培養(yǎng)基的最適配方為:葡萄糖1%、蛋白胨1%、鹽酸.L.半胱氨酸0.05%、MgS04·7H20 0.02%、MnS04·4H20 O.005%、吐溫80 O.1%、番茄汁23.8%、酵母膏0.52%、檸檬酸氫二銨0.34%,pH 4.9。與優(yōu)化前相比,全細(xì)胞脫氫酶活力提高了133.4%;菌體細(xì)胞量提高了12.8%?! ? (2)通過搖瓶靜置發(fā)酵對0.DP刀f CECT4730發(fā)酵產(chǎn)酶的非營養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,確定的最適條件為:種齡36 h,接種量10%,溫度30 ,起始pH 4.9,裝液量為200 m拋50rnl。以7 L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵放大試驗,發(fā)現(xiàn)接種前充入C02形成厭氧環(huán)境更有利于該菌的生長和產(chǎn)酶,該菌對剪切力敏感,最適攪拌轉(zhuǎn)速為50 r/mill,與搖瓶靜置發(fā)酵相比,發(fā)酵周期縮短了約4 h,全細(xì)胞脫氫酶活力(12.91 Uvs 12.84 U)和菌體細(xì)胞量(OD600)(1.597 vs 1.574)均有一定程度的提高?! ? (3)運(yùn)用原位分離技術(shù)構(gòu)建了適合D DP刀f CECT4730全細(xì)胞催化反應(yīng)的新的Tis-HCl/正壬烷兩相反應(yīng)系統(tǒng)。通過對搖瓶反應(yīng)中的限制性因素的考察,發(fā)現(xiàn)吲圪(v~)、pH、溫度、搖床轉(zhuǎn)速、輔助底物及底物濃度等均能對反應(yīng)產(chǎn)率和反應(yīng)初速度產(chǎn)生明顯影響,而只有pH和溫度能對產(chǎn)物ee值產(chǎn)生影響。在最適反應(yīng)條件下(吲圪1:1、pH 8.O、溫度30 、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min、輔助底物葡萄糖和細(xì)胞用量比5.4:1(朋砌)、細(xì)胞和底物的用量比0.51:l(舢01)),當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到0.94 mo兒時,反應(yīng)24 h,時空產(chǎn)率的最大值比前期的研究提高了26.3%,達(dá)24伽mo兒.h,產(chǎn)物的ee僻)>98%。   (4)從2 L發(fā)酵液中約11 g濕菌體開始目的酶的純化,經(jīng)超聲波破碎細(xì)胞、硫酸銨鹽析、Q-Sepharose—FF陰離子柱層析、Sephacryl S·200凝膠柱層析后,得到約0.36 mg電泳純的(R).ADH,活力為254.5 U/mg,酶活收率為2.4%,純化倍數(shù)約25.6倍。純酶的催化反應(yīng)遵循反Prelog規(guī)則,還原2.辛酮得到的產(chǎn)物的ee(尺)達(dá)到98.9%?! ? (5)該酶的主要酶學(xué)性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn):其分子量為100 l(Da仕10 kDa,亞基分子量49 kDa(士2 kDa),為雙亞基結(jié)構(gòu)。最適pH為8.0,最適溫度為30 oC,均與全細(xì)胞催化反應(yīng)的最適條件一致。Pb2+,A礦,和H礦+對其活力有較大的抑制作用;Fe3+,cu2+和zn2+次之。其底物選擇性按2.己酮<2.庚酮<苯乙酮<2.辛酮的順序表現(xiàn)為越來越適合該酶催化,而這些甲基酮取代基的大小依次為C4H曠

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發(fā)布:2007-11-16 14:59    編輯:泛普軟件 · xiaona    [打印此頁]    [關(guān)閉]
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